抗真菌药物研制新技术

       2004-12-24
       随着深部真菌感染率的不断升高和现有抗真菌药物耐药性的日趋严重，临床上对广谱、高效、低毒的新型抗真菌药物的需求日益迫切，仅仅依靠对现有药物进行大量的结构修饰来发现新型抗真菌药物已远远不能满足临床需要。近年来，分子生物学、结构生物学、计算化学和组合化学等学科得到飞速发展，给新药研究领域带来了革命性的突破。这些新技术已经开始应用于抗真菌新药的研究，并取得了一定成功，大大加快了发现抗真菌新药的速度。
       ■真菌基因组学和蛋白质组学
       近年来，真菌基因组学的研究得到了飞速发展。截至2001年，临床上三大致病真菌（白色念珠菌、烟曲霉菌和新型隐球菌）的基因组序列已完成测序，这给新型抗真菌药物研究带来了革命性的突破。通过生物信息学技术，可在不同种属真菌基因序列和人类基因序列间进行比较分析研究，从而能发现人类所没有的而在不同种属真菌中保守的基因，再深入了解这些基因的功能，由此发现功能性基因。蛋白质组学的飞速发展可在短时间内将这些功能基因翻译的蛋白进行表达和纯化，然后对这些蛋白的生物学功能进行分析研究，从中寻找抗真菌药物作用的靶标。基于这些新靶标进行药物设计，有望能够发现具有广谱抗真菌活性、毒副作用低、无交叉耐药性的抗真菌新药。
       ■计算机辅助药物设计技术
       随着分子生物学和结构生物学的飞速发展，将会有越来越多的抗真菌药物作用靶标的三维结构被测定。即使目前有些靶标的三维结构还难以测出，也可通过同源模建方法建立其三维分子模型。基于抗真菌药物作用靶酶的三维结构信息，运用分子对接、虚拟高通量筛选和全新药物设计等技术，可设计出与靶酶特异性结合的全新抗真菌先导化合物，然后对先导化合物进行结构优化，有望能发现具有全新作用机制、全新结构类型的抗真菌新药。
       第二军医大学药学院通过同源模建方法模建了氮唑类抗真菌药物作用靶酶——羊毛甾醇14α－去甲基化酶的三维结构，并阐述了与血红素辅基作用的残基、与电子供体作用和参与电子传递的残基、底物进出通道残基和活性位点残基。选用4种结构类型的15个氮唑类抗真菌药物，以活性类似物法搜寻药效构象，并将各化合物以药效构象对接到白色念珠菌羊毛甾醇14α－去甲基化酶活性部位，详细探讨了唑类抗真菌药物与靶酶的作用模式。在此基础上，基于羊毛甾醇14α－去甲基化酶的活性位点进行新型抑制剂先导结构的设计。首先采用InsightII/Bin-dingSiteAnalysis模块详细分析了靶酶活性位点的空穴大小，然后应用Insigh-tII/MCSS模块分析了活性位点的各种力场分布，在此基础上通过InsightII/ludi模块设计得到了4个先导化合物。设计合成的4个先导化合物对测试的8种人类致病真菌都有抑菌效果，为首次报道的一类新结构类型的抗真菌化合物。经进一步抑酶活性实验证实，这4个先导化合物确为羊毛甾醇14α－去甲基化酶抑制剂，而且与氟康唑是竞争性抑制关系。设计的新型抗真菌化合物只谋求与真菌羊毛甾醇14α－去甲基化酶活性位点残基通过非共价键可逆结合，避开了氮唑类药物由于与蛋白质血红素辅基结合而造成的在真菌和人的靶酶之间缺乏选择性的问题。
       ■组合化学
       组合化学技术的发展与成熟使得在短时间内合成大量化合物成为可能，将组合化学技术应用于新药研究，无疑会提高发现先导化合物的数量和速度。近年来，组合化学技术开始应用于抗真菌药物研究，并在抗真菌先导化合物的发现和优化方面取得了一定成功。通过组合化学技术发现新型抗真菌先导化合物的基本思想是：挑选具有潜在抗真菌活性的起始模板结构，在此基础上设计具有结构多样性的组合库，然后采用固相合成技术迅速合成组合库中的化合物，最后进行抗真菌活性筛选。目前研究较多的抗真菌起始模板结构主要集中在以下四个领域：具有抗真菌活性的天然产物、杂环类化合物、多肽类化合物和抗真菌寡核苷酸。
       国外课题组以4－甲酰基咪唑为起始模板结构，设计了7个结构类型的1H－咪唑－4－甲基氨基磺酰基取代化合物组合库，采用固相合成技术合成组合库中数千个化合物，从5个结构类型中都发现了体外抗真菌活性很强的先导化合物。与依靠经典的药物结构修饰来提高抗真菌活性的方法相比，采用组合化学技术发现和优化抗真菌先导化合物可降低成本，并大大提高了发现新药的效率。
       随着临床上三大致病真菌基因组序列测序的完成，抗真菌药物研究也进入了后基因组时代。真菌基因组学、蛋白质组学、生物信息学和结构生物学等多学科的相互交叉渗透，有望能够发现和确证真菌所特有的药物作用靶标，再采用计算机辅助药物设计技术开展合理药物设计，结合以组合化学技术快速大量合成和以高通量筛选技术快速准确筛选，有望能够大大加快发现特异性强、毒副作用低、无交叉耐药性的新型抗真菌药物的速度。