“肾”研究成果对中西医结合研究思路的启示

       □ 沈自尹　复旦大学中西医结合研究所
       中西医结合是没有前人的经验可以借鉴的，正像改革开放是摸着石头过河，不断用试错的方法摸索前进。中西医结合的核心是“各取所长、优势互补”，基础研究就是要挖掘与发扬中医的长处，中医学对世界医学的贡献之一就是整体观，中医辨证时即使一个局部的病变都要结合整体来考虑。至于研究方法与目的是不断推出原创性成果，中医也曾有个别名家凭其天才的悟性做出原创性的理论描述，如明代赵献可的命门学说，清代叶天士的卫、气、营、血学说，但要300年才能出现一个原创性的亮点。西方在短短100年里借助科学技术的发展，原创性研究精彩纷呈。中西医结合基础研究也要与时俱进，善于汲取国际科学前沿的新观点、新学说、高新科技方法，在发扬整体观的前提下，从高起点取中西医之长，探寻原创性的切入点。
       有必要对“肾”的研究所走过的路作一回顾，尤其是近十年按照整体观及与时俱进的指导思想下进行的探索。回顾最初发现肾阳虚患者肾上腺皮质功能低下，追索到脑垂体功能低下、下丘脑功能紊乱，进而在正常人10例、肾阴虚11例、肾阳虚16例都作了下丘脑—垂体—肾上腺(HPA)轴全套测定，这样设计的检测是很有说服力的，在20世纪初60年代的世界潮流中是属于先进的，得出了肾阳虚患者HPA轴有不同环节（层次）、不同程度功能紊乱的结论，这篇论文被邀请在我国最高学府协和医院的演讲厅宣讲，这意味着必须采用当代最先进的技术方法来研究中医才能获得原创性成果，跟上时代的节拍。将理论研究成果指导临床实践，用补肾药改善HPA轴功能紊乱的难治性疾病，如用温补肾阳药预防哮喘季节性发作1008例，补肾药显效率为57.7%~86.9%，而对照组仅为5%~22.6%；又如用补肾药使5000例儿童肾病综合征激素依赖者90%撤除激素，达到“调节整体、改善局部”的目的。
       到了21世纪初，基因科学导致医学革命，亦给中医药现代化带来了机遇，为深入研究肾阳虚本质，采用全基因组芯片干预两种模型（老年大鼠为肾虚模型，皮质酮大鼠为肾阳虚模型）。取材下丘脑、垂体、肾上腺、淋巴细胞(HPAT)组织，由已证明能代表温肾复方的淫羊藿总黄酮(EF)以药测证，两次（2004年及2005年）进行肾虚及肾阳虚的HPAT轴基因表达谱的差异比较，结果显示两种模型大鼠与青年大鼠的比较，在HPAT轴上首先是众多神经递质下调，接下来是肾上腺、性腺、甲状腺以及生长激素，其表达下调的模式呈高度一致。EF能逆转两个模型组下调的基因表达，其区别在于皮质酮大鼠还显著上调热休克蛋白(HSP70)和细胞色素P450以及促甲状腺激素(TSH)上调达128倍，说明两组大鼠均具有肾虚的内涵，但肾阳的主要物质基础是甲状腺激素促进能量代谢的氧化磷酸化过程。
       第二部分是肾虚与衰老的研究，肾气盛衰关乎生长衰老，在《内经》中有经典的描述。我们在补肾延缓衰老课题中，先是观察到EF能延长人二倍体成纤维细胞传代寿命，其原理是EF保护了衰老细胞的端粒，延缓端粒长度的缩短。2004年系统生物学从国际上波及到国内，中医药学本来就是系统先进的生命科学认知体系，把系统生物学和分子生物学及数学相结合并引入到肾虚与衰老的研究中，实验设计是在代表青、壮、衰、老的4、10、18、24不同月龄段大鼠的三个层次的检测。第一层次是与肾相关的下丘脑、垂体、肾上腺、淋巴细胞、骨、肝、肾7个组织块，用全基因组的芯片作基因表达谱，并用EF对24月龄加以干预。所有组织块显示具有统计学意义的主流基因表达数据都有一个共同特征，即随增龄而表达降低，至24月龄降至谷底，经EF干预均显著升高，用数学神经网络BP学习法运算，发现EF能将24月龄各相应组织年轻化到8.10~13.14月龄水平，逆转了衰老。第二层次是核因子kB(NFkB)信号通路，已经发现NFkB调控免疫衰老的功能随着年龄增长而显著下降，选用含NFkB相关基因的专用芯片，取材淋巴细胞，仍在以上同样的不同月龄及EF组大鼠上进行检测，结果发现NFkB信号通路（包括6个基因家族成员）随增龄而下降，而EF作用之后上升，经神经网络运算显示能将该通路基因表达水平从24月龄逆转到10.5月龄水平。第三层次是代谢组学的研究，也是取以上不同月龄和EF组大鼠血清样本，采用液相色谱和质谱的检测。经主要成分分析及多元统计确定17个生物标志物，其中12个亦具有共同特征，即随增龄而下降，EF使之上升，神经网络运算显示EF能将12个代谢物从24月龄逆转到18个月龄水平。用系统生物学观点进一步研究EF对衰老时基因相关联系的效果，在第一层次的实验中对各月龄段基因表达谱中，通过超几何分布计算出衰老进程中所有反映基因关联的节点（指两个基因群具有共同的基因），把具有显著关联性的节点连接起来形成一个个空间关联网络。通过聚类分析，可以看到随着增龄，节点关联由密变疏，EF作用后，各组织的基因关联向10月龄靠近。EF除了使24月龄大鼠三个层面上基因老化程度得以逆转，亦使老年时基因时空关联的弱化程度得以逆转。
       第三部分是从EF激活内源性干细胞探讨“肾藏精”科学涵义。基因组学是生物学上的一次技术革命，干细胞则是又一次技术革命，即将成为主流的科学研究前沿。目前，国际上对干细胞的研究和应用上都是着眼于移植和克隆，而通过药物激活内源性的干细胞从而改善再生反应与从外部植入干细胞是全然不同的新思路。干细胞的基本功能是“自我更新”和“定向分化”，这两项功能都需要合适的微环境，尤其是定向分化，微环境起决定性作用。“肾藏精”中精的来由按《灵枢·决气篇》“两神相博，合而成形，常先身生，是为精”说明先天之精秉受于父母，是构成人体胚胎的原始物质，因此肾所藏之精可相应于胚胎干细胞以及其它分化为各种组织器官的成体干细胞，干细胞具有先天之精的属性。“藏”的含义按《素问·六节藏象论》“肾者主蛰，封藏之本，精之处也”，干细胞一般处于休眠状态，只有出现损伤或刺激时才会被唤醒（激活），提示精平时是藏而不露的，这对肾藏精有进一步的理解。能同时激活干细胞和发挥微环境作用的中医药可设想为温补命火药。我们的前期工作证明温补肾阳药可以提高全身的神经—内分泌—免疫(NEI)网络功能，体现为赵献可在《医贯》里所述命门之火周行全身的温煦与推动作用，值得注意的是能提高NEI网络功能的4个经典及自拟的温肾复方中都有淫羊藿，还有李时珍《本草纲目》为证：“淫羊藿味甘气香，性温不寒，能益精气，乃手足阳明命门药也”，故采用EF进行激活内源性干细胞的实验观察，作了一些起步的研究。
       通过EF对皮质酮大鼠肾上腺皮质干细胞的作用及机制的实验研究显示，EF激活肾上腺皮质干细胞增殖和迁移，从而促进肾上腺皮质再生。
       为进一步证明EF对干细胞激活的直接作用，体外分离培养胚鼠神经干细胞，实验分为对照组、淫羊藿苷（EF中的一单体成分）低、中、高剂量组，作用24h后，采用MTT和BrdU法检测神经干细胞的增值状态。结果显示对照组、淫羊藿苷低、中、高剂量组的吸光度值分别为0.52±0.05，0.43±0.07，0.74±0.15，0.69±0.10，中剂量与高剂量与对照组比较，促增值活性显著升高(P<0.001)，表明淫羊藿苷能显著促进神经干细胞增值。
       关于温补命火药能否同时激活干细胞和微环境，现代研究认为干细胞周围的微环境似龛，内有密集高浓度的相关转录因子、促生长因子、营养因子等，指引干细胞增殖分化以促生长因子显得重要，已有报道Notch配体、成纤维生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)对干细胞的自我更新有显著的调节作用，并证实促进干细胞的增殖和迁移。我们在皮质酮大鼠和老年大鼠采用基因芯片技术，都观察到EF使得生长激素GH、GHRH及各类促生长因子如IGF、TGF、FGF、EGF、NGF等基因表达从下调的状态全面翻转上调，证明EF具有强烈的促生长作用，从而提供有利于干细胞增殖分化的微环境。
       以上显示温补命火药EF能同时激活促生长因子（微环境）与干细胞增殖并迁移归巢，从而有助于阐明肾藏精与命门之火理论的科学涵义。
       我们经历了半个世纪，尤其是近十年的中西医结合肾的研究，在肾阳虚本质、肾虚与衰老、肾藏精三个方面，按照中医整体观的思路以及与时俱进的科学前沿如基因组学、系统生物学和干细胞的研究方法，陆续取得原创性成果。
       西医学习中医进行中西医结合是史无前例的创举，鉴于中西医理论体系的相融难度甚大，不是一代人所能完成，理应加以扶持而不是挑剔冷落，只有动员各种力量来阐明中医理论的科学内涵，这样中医和西医才能真正地平起平坐。我国现代医学瞄准着西方医学，所以在思维上还受着还原论的统治，因此中医基础研究必须擅于抓住中医理论中的精华，紧紧关注世界科学前沿和最新发展，结合到科研中才有较高的起点。
       中医基础研究涉及的知识面很广，难度亦大，在这当前讲求经济效益的氛围下，特别需要有勤勤恳恳、耐得住寂寞、具有为科学献身中医事业并有与多学科协作精神的团队，这样才能将中医基础研究不断拓宽并引向深入。循此以往，相信中医基础研究会不断呈现新的局面，还将对生命科学做出贡献。